Nota: Los datos complementarios de este artículo están disponibles en Clinical Cancer Research Online (http://clincancerres.aacrjournals.org/).J. Xu e Y. Fang contribuyeron igualmente a este artículo.Junfen Xu, Yifeng Fang, Kelie Chen, Sen Li, Sangsang Tang, Yan Ren, Yixuan Cen, Weidong Fei, Bo Zhang, Yuanming Shen, Weiguo Lu;La secuenciación de ARN de una sola célula revela la arquitectura del tejido en el cáncer de ovario seroso de alto grado humano.Clin Cancer Res 15 de agosto de 2022;28 (16): 3590–3602.https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-22-0296La heterogeneidad del cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) no está bien estudiada, lo que dificulta gravemente el tratamiento clínico de HGSOC.Por lo tanto, es necesario caracterizar la heterogeneidad de HGSOC dentro de su microambiente tumoral (TME).Los tumores de 7 pacientes sin tratamiento previo con HGSOC en etapas tempranas o tardías y cinco muestras de ovario no maligno de la misma edad se analizaron mediante secuenciación profunda de ARN unicelular (scRNA-seq).Se secuenciaron un total de 59.324 células individuales obtenidas de HGSOC y tejidos ováricos no malignos mediante scRNA-seq.Entre esas células, las células tumorales se caracterizaron por un conjunto de firmas genéticas asociadas a la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT), en las que se seleccionó además una combinación de NOTCH1, SNAI2, TGFBR1 y WNT11 como panel genético para predecir la mala resultados de los pacientes con HGSOC.Los fibroblastos asociados con el cáncer de matriz (mCAF) que expresan α-SMA, vimentina, COL3A, COL10A y MMP11 fueron los CAF dominantes en los tumores HGSOC y podrían inducir las propiedades EMT de las células de cáncer de ovario en el sistema de cocultivo.Los subconjuntos de células inmunitarias específicas, como los macrófagos C7-APOBEC3A M1, las células CD8+ TRM y TEX, se enriquecieron preferentemente en los tumores en etapa temprana.Además, un receptor coinhibitorio inmunitario TIGIT se expresó en gran medida en las células TEX CD8+ y el bloqueo de TIGIT podría reducir significativamente el crecimiento de tumores de cáncer de ovario en modelos de ratón.Nuestros resultados transcriptómicos analizados por scRNA-seq delinean un paisaje ecosistémico de HGSOC en etapas tempranas o tardías con un enfoque en su heterogeneidad con TME.Las principales aplicaciones de nuestros hallazgos son un modelo de cuatro genes EMT para la predicción de los resultados de los pacientes con HGSOC, la capacidad de los mCAF para mejorar la invasión de células de cáncer de ovario y el valor terapéutico potencial del tratamiento anti-TIGIT.El cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC, por sus siglas en inglés) representa aproximadamente el 80 % del total de muertes por cáncer de ovario.Actualmente, todavía hay una falta de estrategias clínicas efectivas para el tratamiento de HGSOC.Nuestros estudios se centran en las características de expresión genética de diferentes poblaciones celulares de HGSOC en sus diversos estadios tumorales, lo que contribuirá a desarrollar nuevas estrategias de tratamiento.En el estudio actual, se realizó una secuenciación profunda de ARN unicelular (scRNA-seq) para analizar tumores de 7 pacientes sin tratamiento previo con HGSOC en diferentes etapas y cinco muestras de ovario no malignas de la misma edad.Entre los genes expresados ​​diferencialmente identificados por scRNA-seq, se seleccionó una combinación de marcadores de transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) NOTCH1, SNAI2, TGFBR1 y WNT11 y este panel podría aplicarse para predecir los malos resultados de los pacientes.Además, se confirmó que los efectos de los fibroblastos primarios asociados con el cáncer inducen la EMT de células tumorales.Además, examinamos los efectos del receptor coinhibidor inmunológico TIGIT en el cáncer de ovario y descubrimos que el bloqueo de TIGIT podría aliviar la carga tumoral en ratones con tumores ID8, lo que sugiere un posible objetivo de inmunoterapia para el tratamiento con HGSOC.El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más letal, con 184 799 muertes de mujeres al año en todo el mundo (1, 2).Entre todos los subtipos de cáncer de ovario, el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC, por sus siglas en inglés) es el fenotipo más común, responsable de aproximadamente el 80 % de todas las muertes por cáncer de ovario (3).Debido a los síntomas ambiguos, solo el 20% de los casos de esta neoplasia maligna pueden identificarse en las primeras etapas para un tratamiento exitoso.La mayoría de los HGSOC progresan a etapas avanzadas posteriores con malos resultados para los pacientes, lo que refleja la naturaleza agresiva de esta enfermedad (4, 5).Incluso después de la terapia, HGSOC a menudo recurre debido al desarrollo de quimiorresistencia, con una probabilidad de supervivencia general a los 5 años del 31 % (6, 7).Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos efectivos para pacientes con HGSOC es imperativo para un mejor pronóstico y supervivencia general (SG).HGSOC presenta varias funciones.Uno de ellos es el proceso de transición epitelial a mesenquimatosa (EMT, por sus siglas en inglés) (7, 8), que es un mecanismo importante que subyace a la invasión y metástasis del cáncer de ovario, así como a la quimiorresistencia (9, 10).Los pacientes con HGSOC con el programa transcripcional EMT activado exhibieron peores resultados (11).La inhibición de la EMT por la simvastatina suprime la metástasis y la invasión de células cancerosas (12).Otro sello distintivo es la heterogeneidad del tumor (13), caracterizada por su microambiente tumoral (TME; ref. 14).La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) es una poderosa herramienta de análisis para revelar información TME de HGSOC.Por ejemplo, un estudio anterior que utilizó scRNA-seq mostró que la inhibición de la vía JAK/STAT tenía potentes actividades antitumorales (15).Otro trabajo proporcionó una caracterización amplia de la composición celular asociada con tres fenotipos inmunes a tumores (es decir, infiltrado, excluido o desierto; ref. 16).Un informe reciente caracterizó ciertos fenotipos de células estromales en la regulación de TME en cánceres tuboováricos serosos de alto grado, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) impulsados ​​por TGFβ, las células endoteliales linfáticas y las células mesoteliales (17).Un enfoque para regular la TME es a través de la mediación de los comportamientos de las células inmunitarias y el ligando de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-L1), que es un elemento fundamental del punto de control de la supresión de las células T (18), se ha estudiado para inmunoterapias contra el cáncer de ovario, pero con impactos limitados .Una de las principales razones es que PD-L1 se reguló positivamente en solo aproximadamente el 1,3 % (14/1052) de las pacientes con carcinoma epitelial de ovario, lo que indica que este enfoque no podría explicar la mayoría de los casos de cáncer de ovario (19).Por lo tanto, es significativamente beneficioso revelar características celulares en diferentes etapas HGSOC por scRNA-seq, lo que proporciona información más precisa para desarrollar inmunoterapias apropiadas dirigidas a etapas específicas de la enfermedad.Aquí, caracterizamos en detalle el panorama transcriptómico unicelular completo de los tumores HGSOC primarios en etapas clínicas tempranas y avanzadas.Las jerarquías de desarrollo de las células epiteliales se describieron mediante análisis de pseudotiempo en diferentes etapas del tumor y se identificaron las propiedades de la EMT.En particular, en la mayoría de los CAF en tejidos HGSOC, los CAF de matriz (mCAF) mejoraron significativamente la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario.Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos C7-APOBEC3A M1, las células CD8+ TRM y las células CD8+ TEX, se expresaron principalmente en tumores en etapa temprana.Además, el bloqueo del receptor inmunocoinhibidor TIGTI suprimió el crecimiento tumoral de modelos de ratones C57BL/6 derivados de ID8.En conjunto, nuestro estudio informó los aspectos únicos de TME de HGSOC y las características de las células tumorales asociadas con las etapas del tumor, lo que ayudará a desarrollar nuevas estrategias clínicas para el tratamiento de HGSOC.Se recolectaron muestras de tumores HGSOC de pacientes que se habían sometido a salpingo-ooforectomía bilateral (BSO)/histerectomía + estadificación integral o citorreducción en el Hospital de Mujeres de la Universidad de Zhejiang.Se recolectaron muestras de ovario no maligno de pacientes que se sometieron a salpingo-ooforectomía unilateral o BSO, respectivamente y/o histerectomía debido a enfermedades ginecológicas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad de Zhejiang.Obtuvimos la parte normal de los ovarios no malignos.Los tejidos frescos se diseccionaron inmediatamente en fracciones para la digestión enzimática en células individuales y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% seguido de inclusión en parafina.Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital de Mujeres de la Universidad de Zhejiang (IRB-20200186-R).Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente.Los experimentos de scRNA-seq fueron realizados por personal experimental en el laboratorio de Novel Bio Co, Ltd. Los tejidos se extrajeron quirúrgicamente y se mantuvieron en solución de almacenamiento de tejidos MACS (Miltenyi Biotec) hasta su procesamiento.Las muestras de tejido se procesaron como se describe a continuación.Brevemente, las muestras primero se lavaron con PBS, se picaron en trozos pequeños (~1 mm3) en hielo y se digirieron enzimáticamente con 125 U/mL de colagenasa IV (Sigma), 25 U/mL de colagenasa I (Sigma) y 25 U/mL de colagenasa IV (Sigma). DNasa I (Worthington) durante 30 minutos a 37°C, con agitación.Después de la digestión, las muestras se tamizaron a través de un filtro de células de 40 μm y luego se centrifugaron a 300 × g durante 5 minutos.Se eliminó el sobrenadante y las células sedimentadas se suspendieron en tampón de lisis de glóbulos rojos (Solarbio) para lisar los glóbulos rojos.Las células se resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % y se volvieron a filtrar a través de un filtro celular de 35 μm.A continuación, las células individuales disociadas se tiñeron con naranja de acridina/yoduro de propidio para evaluar la viabilidad usando un analizador de células de fluorescencia Countstar.La suspensión unicelular se enriqueció adicionalmente con un kit de eliminación de células muertas MACS (Miltenyi Biotec).Las bibliotecas de scRNA-seq se generaron utilizando el instrumento controlador de cromo 10x Genomics y los kits de reactivos V3 de células únicas de cromo 3' (10x Genomics).Brevemente, las células se concentraron a 1000 células/μL y se cargaron aproximadamente 8000 a 10 000 células en cada canal para generar perlas de gel en emulsiones (GEM) unicelulares, lo que resultó en el código de barras de ARNm esperado de 3000 a 8000 células individuales para cada muestra.Después del paso de transcripción inversa, los GEM se rompieron y el ADNc con código de barras se purificó y amplificó.El ADNc con código de barras amplificado se fragmentó, se aplicó una cola A, se ligó con adaptadores y se amplificó mediante PCR índice.Las bibliotecas finales se cuantificaron utilizando un ensayo de ADN de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific) y la distribución de tamaño de estas bibliotecas se determinó mediante un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2200 (Agilent).A continuación, todas las bibliotecas se secuenciaron mediante un secuenciador Illumina (Illumina) en una ejecución de extremos emparejados de 150 pb.El análisis de datos de scRNA-seq fue realizado por NovelBio Co. Ltd. con NovelBrain Cloud Analysis Platform (www.novelbrain.com).Aplicamos fastp con el filtrado de parámetros predeterminado de la secuencia del adaptador y eliminamos las lecturas de baja calidad y las lecturas cortas para obtener datos limpios (20).Luego, las matrices de códigos de barras de características se obtuvieron alineando las lecturas con el genoma humano (GRCh38 Ensemble: versión 91) usando CellRanger v3.1.0 y determinando los parámetros de celda reales que se esperan para aquellos con recuentos de celdas iguales a 10,000 considerando el UMI y Cell-UMI. Pendiente.Además, para resolver el sesgo causado por la secuenciación desequilibrada, aplicamos el análisis de reducción de muestra mediante la función CellRanger Aggr entre muestras secuenciadas de acuerdo con las lecturas de código de barras mapeadas por celda de cada muestra y finalmente logramos la matriz agregada.Las células que contenían más de 200 genes expresados ​​y una tasa de UMI mitocondrial específica de tejido (por debajo del 40 %) pasaron el filtrado de calidad celular y los genes mitocondriales se eliminaron de la tabla de expresión.Se utilizó el paquete Seurat (versión: 3.1.4, https://satijalab.org/seurat/) para la normalización y regresión celular con base en la tabla de expresión según los conteos UMI de cada muestra y el porcentaje de mitocondrias para obtener el escalado. datos.El análisis de componentes principales se construyó sobre la base de los datos escalados con los 2000 genes altamente variables principales, y los 10 principales principales se usaron para la construcción de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP).Se aplicó el análisis de correlación canónica (CCA) en el paquete Seurat para la eliminación del efecto por lotes y la agrupación primaria.Utilizando el método de conglomerados basado en gráficos, adquirimos el resultado del conglomerado de células no supervisado basado en el principio de los 10 principales de CCA y calculamos los genes marcadores mediante la función FindAllMarkers con el algoritmo de prueba de suma de rangos de Wilcoxon bajo los siguientes criterios: (i) logFC > 0,25 ;(ii) P < 0,05;y (iii) PCT mín. > 0,1.El tipo de célula se definió mediante biomarcadores basados ​​en el conocimiento.Para la subagrupación de cada tipo de célula, considerando que el algoritmo CCA funcionó peor entre los algoritmos de efecto por lotes causados ​​por sobrecorrección, aplicamos el algoritmo MNN del paquete scran (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/ html/scran.html) para subagrupar el análisis del efecto por lotes con un valor k igual a 5. Sobre la base de los resultados de MNN, se utilizó la agrupación basada en gráficos con parámetros óptimos y el análisis de marcadores como se indicó anteriormente para la agrupación e identificación de células.Aplicamos GSVA (1.32.0; ref. 21) para el análisis de puntaje relacionado con el sistema inmunitario y utilizamos la prueba de suma de rangos de Wilcox para calcular la importancia entre los tumores en etapa temprana y en etapa tardía.Se seleccionaron valores Padj <0,01 como estadísticamente significativos.La línea celular de cáncer de ovario humano OVCAR3 se obtuvo de la ATCC, y A2780 se obtuvo de Sigma.Estas líneas celulares se verificaron mediante repetición corta en tándem y sin contaminación por Mycoplasma.Las células OVCAR3 se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %.Las células A2780 se cultivaron en medio RPMI1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %.Para determinar el efecto de los CAF en la EMT de células de cáncer de ovario a través de un sistema de cocultivo Transwell (Corning, 3460), se colocaron 5 × 104 CAF en el inserto superior con membranas de policarbonato de tamaño de poro de 0,4 μm, y se colocó la misma cantidad de células de cáncer de ovario. sembrado debajo del inserto transwell de las placas de 12 pocillos.Las células se cocultivaron durante 48 horas.Las células de cáncer de ovario se examinaron más a fondo mediante análisis de transferencia Western para determinar la expresión de ZEB1 (Tecnología de señalización celular, 3396, 1:1000), vimentina (Tecnología de señalización celular, 5741, 1:5000), caracol (Tecnología de señalización celular, 3879, 1 :1,000) y GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, sc47727, 1:4,000).Las bandas de proteínas en las transferencias se cuantificaron mediante el software Cantidad Uno (Bio-Rad Laboratories, Inc).Los datos representan tres experimentos independientes (media ± SD).Para el ensayo Transwell, primero se cultivaron 5 × 104 CAF durante 24 horas.Se sembró la misma cantidad de células de cáncer de ovario en el pocillo superior de membranas grabadas con seguimiento de PET de tamaño de poro de 8 μm (FALCON, 353097) recubiertas con Matrigel (Corning, 356234).Después de la coincubación durante 24 horas, las células que invadieron el lado opuesto del filtro se tiñeron con cristal violeta al 0,5% y se contaron bajo el macroscopio (Leica DMI 4000B).Los datos representan tres experimentos independientes (media ± SD).Para evaluar el efecto pronóstico de genes individuales o cada conjunto de genes característicos derivados de grupos específicos, se emplearon datos TCGA-OV, GSE26712 (22), GSE13876 (23) y GSE9891 (24).Los datos de expresión del gen TCGA-OV y los datos de supervivencia se descargaron de UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/).Al evaluar el efecto de cada conjunto de genes distintivos sobre la supervivencia, la expresión media de los genes distintivos se escaló mediante puntuaciones z para representar el nivel de expresión relativo de los genes distintivos.Para todos los análisis de supervivencia, los pacientes se agruparon en grupos de expresión alta y baja según el punto de corte óptimo.Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se dibujaron en R-4.0.3 con el paquete R survminer (25).Todos los ratones experimentales se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos y todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica China de Zhejiang (20211129-21).Ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad se inocularon por vía subcutánea con 5 × 106 células ID8.Las células ID8 fueron obsequiadas por el laboratorio del Prof. Chen Dong (Universidad de Qinghua, Beijing, PR China).El crecimiento tumoral se midió regularmente con calibradores y el volumen se calculó como 0,5 × largo × ancho2.El día 56 (el promedio de tumores alcanzó los 100 mm3), los ratones se aleatorizaron en el grupo de tratamiento y se trataron con anti-TIGIT (200 μg, clon: 1B4, anticuerpo absoluto) o anticuerpo de control de isotipo coincidente (200 μg) mediante inyección intraperitoneal cinco veces ( una vez cada 3 días).El día 76, los ratones se sacrificaron para análisis posteriores.Los tejidos tumorales se trituraron y se digirieron con colagenasa IV (1 mg/ml, Sigma) y ADNasa I (1 mg/ml, Roche) en RPMI1640 (Gibco) durante 1 hora a 37ºC.Las suspensiones de células resultantes se filtraron a través de un filtro de células de 70 μm antes de la centrifugación en un gradiente de Percoll discontinuo (GE Healthcare Life Sciences).A continuación, las células aisladas se usaron en citometría de flujo.Los datos de scRNA-seq que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en la plataforma Gene Expression Omnibus (GEO) con el código de acceso "GSE184880".Para los experimentos celulares y el estudio con animales, el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9.2.Las comparaciones se evaluaron mediante la prueba t de Student o ANOVA de una vía.Se usó ANOVA de dos vías para comparar las curvas de crecimiento tumoral.Los datos se presentan como media ± SD.P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.Para interrogar sistemáticamente la heterogeneidad intratumoral de HGSOC, realizamos scRNA-seq profundo en células ováricas individuales de 12 pacientes sin tratamiento previo, incluidos 7 pacientes con HGSOC y 5 pacientes de la misma edad con ovarios no malignos (Tabla complementaria S1).Los ovarios no malignos analizados aquí fueron de mujeres perimenopáusicas o posmenopáusicas como controles HGSOC adecuados de la misma edad.Se adquirió un total de 59.324 células de estas muestras siguiendo procedimientos estándar (Materiales y Métodos).De estos, 33 264 células (56 %) eran de tumores HGSOC y 26 060 (44 %) eran de ovarios no malignos (Fig. 1A; Fig. S1A y S1B complementarias; Tabla complementaria S2).Luego, estas células se agruparon (Materiales y Métodos) y se anotaron de acuerdo con la lista de marcadores genéticos establecida.La visualización de las células se realizó utilizando enfoques UMAP, como se muestra en la Fig. 1B.Además, la Fig. 1C demuestra la identificación de tipos de células ecosistémicas, incluidos los linajes de células T (marcados por CD3D, CD3E y CD8A), células epiteliales (marcadas por KRT18, EPCAM, CD24 y KRT19), monocitos (CD14 y C1QA) , tipos de células endoteliales (PECAM1 y CLDN5), células del ciclo celular (MKI67 y TOP2A), células de fibroblastos (DCN y OGN), tipos de células B y células plasmáticas (CD79A y JCHAIN) y células de músculo liso/miofibroblastos (presentados como ACTA2 , MYH11 y TAGLN).Diversos tipos de células en HGSOC y tejidos ováricos no malignos delineados por análisis transcriptómico de una sola célula.A, Flujo de trabajo que representa la recolección y el procesamiento de muestras de tumores HGSOC y tejidos ováricos no malignos para scRNA-seq.B, El gráfico UMAP demuestra los principales tipos de células en HGSOC y controla los tejidos ováricos.C, Gráficos de puntos que muestran los niveles de expresión de genes marcadores específicos en cada tipo de célula.El tamaño de los puntos indica la proporción de células que expresan el gen marcador particular.El espectro de color representa los niveles medios de expresión de los genes marcadores.D, Mapa de calor que muestra vías diferencialmente activadas de cada tipo de célula en los grupos HGSOC y no malignos.E, Distribución de la composición celular para cada grupo con diferentes estadios clínicos.Diversos tipos de células en HGSOC y tejidos ováricos no malignos delineados por análisis transcriptómico de una sola célula.A, Flujo de trabajo que representa la recolección y el procesamiento de muestras de tumores HGSOC y tejidos ováricos no malignos para scRNA-seq.B, El gráfico UMAP demuestra los principales tipos de células en HGSOC y controla los tejidos ováricos.C, Gráficos de puntos que muestran los niveles de expresión de genes marcadores específicos en cada tipo de célula.El tamaño de los puntos indica la proporción de células que expresan el gen marcador particular.El espectro de color representa los niveles medios de expresión de los genes marcadores.D, Mapa de calor que muestra vías diferencialmente activadas de cada tipo de célula en los grupos HGSOC y no malignos.E, Distribución de la composición celular para cada grupo con diferentes estadios clínicos.Los tipos de subconjuntos de células son similares en los tumores HGSOC y los ovarios no malignos (Fig. S1C complementaria), mientras que la distribución celular fue bastante diferente.Por ejemplo, los ovarios no malignos tenían un predominio de fibroblastos, lo que concuerda con el aumento de la fibrosis ovárica en los ovarios envejecidos (26).Por el contrario, los tumores contenían más células T o células epiteliales.Luego se aplicó el análisis de la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto para revelar las características de cada subconjunto de células (Fig. 1D).Para las células epiteliales de los tumores HGSOC, el análisis mostró un enriquecimiento de genes involucrados en la ferroptosis, lo cual es consistente con hallazgos previos (27, 28).Para aquellos en tejidos ováricos no malignos, nuestro trabajo mostró un enriquecimiento de genes en la esteroidogénesis ovárica.A continuación, correlacionamos grupos de células con características tumorales como etapas clínicas.La proporción del grupo de células T disminuyó a medida que avanzaba la etapa del tumor (Fig. 1E; Fig. S1D complementaria).Para verificar esto, examinamos los niveles de expresión del marcador de células T CD3 en 40 casos de tejidos de ovario no maligno y tumor HGSOC en estadio 1, estadio 2 y estadio 3 (n = 10 en cada grupo) usando IHC.Nuestros resultados confirmaron que las proporciones de células inmunitarias positivas para CD3 disminuyeron desde las etapas tempranas hasta las tardías del tumor (Fig. S1E complementaria).A continuación, caracterizamos las características de las células epiteliales tumorales.Las variaciones del número de copias somáticas (CNV) para cada tipo de célula se analizaron utilizando el paquete R infercnv (v0.8.2), y las células epiteliales malignas se determinaron con señales de CNV superiores a 0,05 y correlaciones de CNV superiores a 0,5 (Fig. S2 complementaria).Se recolectó un total de 14 636 células epiteliales de ovario en todos los tejidos y se dividió en un conjunto diverso de 12 grupos, incluidas 8192 células de tumores HGSOC y 6444 células de tejidos ováricos no malignos (Fig. 2A y B).Luego se aplicó CytoTRACE (29) para predecir los estados de diferenciación de estas células epiteliales y para identificar células madre inactivas en HGSOC (Fig. 2C; Tabla complementaria S3).Para explorar más a fondo la red de señalización inmunitaria protumor para estas células, realizamos una puntuación relacionada con la inmunidad en las etapas tumorales tempranas y tardías (Tabla complementaria S4; Figura complementaria S3A).Sorprendentemente, la mayoría de los genes de ligandos responsables de la inhibición del punto de control inmunitario estaban fuertemente enriquecidos en el estadio 1 temprano del tumor, pero significativamente menos en el estadio tardío del tumor.Los niveles de los genes de los ligandos PD-1 y CTAL-4 CD274 (PD-L1) y CD80/86 (B7-1/2) fueron bastante bajos en todas las etapas de HGSOC, lo que es consistente con informes clínicos previos de baja respuesta terapéutica. cuando se aplicó bloqueo contra PD-1 o CTLA-4 en cáncer de ovario (30, 31).De manera diferente, la expresión de VTCN1 aumentó significativamente en el estadio tardío del tumor 3 (Fig. S3A complementaria).Firmas de expresión génica diferencial e impacto de genes asociados a EMT en tumores HGSOC.A, gráfico UMAP con grupos delimitados por colores que demuestran 12 grupos distintos basados ​​en diferencias de expresión génica para 14 636 células epiteliales que pasan el control de calidad.B, El gráfico UMAP delimitado por colores que muestra los dos grupos de tumores HGSOC (malignos) y tejidos ováricos no malignos.C, análisis CytoTRACE de células epiteliales.D, Análisis de pseudotiempo de células epiteliales malignas inferidas por Monocle2.Cada punto corresponde a una sola celda.Se muestra la información del grupo y la etapa.E, Los genes expresados ​​diferencialmente (filas) a lo largo del pseudotiempo (columnas) se agruparon jerárquicamente en tres subgrupos.Se proporcionan las rutas anotadas representativas de cada subclúster.F, la combinación de la expresión de NOTCH1, SNAI2, WNT11 y TGFBR1 se asoció con una peor SG del paciente en la cohorte TCGA HGSOC, la cohorte GSE26712 HGSOC, la cohorte de cáncer de ovario seroso GES9891 y la cohorte de cáncer de ovario seroso GSE13876, respectivamente.Los valores de p se calcularon mediante una prueba de rango logarítmico.G, tinción IF con anticuerpos anti-E-cadherina y vimentina en secciones de tejido HGSOC.Firmas de expresión génica diferencial e impacto de genes asociados a EMT en tumores HGSOC.A, gráfico UMAP con grupos delimitados por colores que demuestran 12 grupos distintos basados ​​en diferencias de expresión génica para 14 636 células epiteliales que pasan el control de calidad.B, El gráfico UMAP delimitado por colores que muestra los dos grupos de tumores HGSOC (malignos) y tejidos ováricos no malignos.C, análisis CytoTRACE de células epiteliales.D, Análisis de pseudotiempo de células epiteliales malignas inferidas por Monocle2.Cada punto corresponde a una sola celda.Se muestra la información del grupo y la etapa.E, Los genes expresados ​​diferencialmente (filas) a lo largo del pseudotiempo (columnas) se agruparon jerárquicamente en tres subgrupos.Se proporcionan las rutas anotadas representativas de cada subclúster.F, la combinación de la expresión de NOTCH1, SNAI2, WNT11 y TGFBR1 se asoció con una peor SG del paciente en la cohorte TCGA HGSOC, la cohorte GSE26712 HGSOC, la cohorte de cáncer de ovario seroso GES9891 y la cohorte de cáncer de ovario seroso GSE13876, respectivamente.Los valores de p se calcularon mediante una prueba de rango logarítmico.G, tinción IF con anticuerpos anti-E-cadherina y vimentina en secciones de tejido HGSOC.Para comprender mejor las funciones de las células epiteliales en el desarrollo de tumores, se aplicó el algoritmo Monocle en un análisis de pseudotiempo para que las células epiteliales malignas proyectaran sus trayectorias de desarrollo.Se agregaron once grupos de células en función de las similitudes de expresión génica y se proyectaron en un proceso de pseudotiempo definido como tumores HGSOC básicos, en etapa 2 y en etapa 3 (Fig. 2D).A lo largo de la trayectoria, la firma genética de las células del grupo 1 en la etapa 3 se caracterizó como ciertas vías funcionales, incluida la adhesión focal, la vía de señalización de estrógenos, la vía de señalización de PI3K-AKT, la vía de señalización de relaxina, la apoptosis y la vía de señalización de rap1 ( figura 2E).Este grupo también expresó un conjunto de genes asociados con EMT, como IGF2 (32), WNT7A (33) y HBEGF (ref. 34; Figura complementaria S3B), lo que sugiere una inducción de EMT.Curiosamente, la firma del gen del grupo 3 con el estadio básico del tumor HGSOC demostró una fuerte asociación de vías metabólicas como se muestra en la Fig. 2E.Los genes de haz en este grupo incluían SOX9, CXCL10 y WNT6 (Fig. S3C complementaria).Además, examinamos la expresión de genes relacionados con EMT en células tumorales HGSOC en diferentes etapas.Treinta y ocho marcadores EMT se expresaron diferencialmente en células HGSOC en comparación con células de control no malignas (Fig. S4A complementaria).Para verificar la asociación de estos marcadores EMT con la supervivencia del paciente, se evaluaron el conjunto de datos TCGA HGSOC, el conjunto de datos GEO HGSOC (GSE n.º 26712) y dos conjuntos de datos de cáncer de ovario seroso (GSE n.º 13876 y n.º 9891) mediante análisis en línea TCGA y GEO con resultados de OS disponibles, en los que se evaluaron 1.202 muestras tumorales.Nuestro análisis mostró que cuatro genes, incluidos NOTCH1, SNAI2, WNT11 y TGFBR1, se asociaron significativamente con un resultado deficiente en al menos tres cohortes de estos cuatro conjuntos de datos de expresión masiva (Figura complementaria S4B–S4S4E).Es de destacar que la combinación de estos cuatro genes se asoció con una peor SG en estos cuatro conjuntos de datos (Fig. 2F).Además, otros genes marcadores de EMT CDH1 y VIM se validaron aún más en tejidos HGSOC mediante análisis de inmunofluorescencia (IF), y los resultados sugirieron que un grupo robusto de células lleva a cabo funciones potenciales de EMT (Fig. 2G).Seguimos estudiando las características de los fibroblastos estromales.De los 13.201 fibroblastos, surgieron 14 grupos celulares (Fig. 3A).Las propiedades de las células madre mesenquimales (MSC) se observaron en muchos fibroblastos específicos de ovario no malignos (Fig. 3A).Se agruparon tres subgrupos de fibroblastos no malignos sobre la base de las características de expresión de cada gen.Los subgrupos de MSC 1, 2 y 3 se denominaron MSC NT5E/THY1/ENG+, células similares a MSC NT5E/ENG+ y células similares a MSC ENG+, respectivamente (Fig. 3A y B).Grupos de fibroblastos en tejidos ováricos no malignos y tumores HGSOC.A, gráfico UMAP con grupos delimitados por colores que demuestran 14 grupos distintos basados ​​en diferencias de expresión génica para 13 201 fibroblastos.B, gráfico UMAP codificado por colores para la expresión (de azul a púrpura) de genes marcadores para los grupos de fibroblastos no malignos como se indica.C, Diagrama de puntos del ligando de quimiocinas de compartimiento cruzado y la expresión del receptor de quimiocinas correspondiente por el tipo de célula de mCAF y TME.La intensidad del color de cada punto representa la expresión media normalizada por scran en todos los pacientes.El tamaño de los puntos indica la proporción de células que expresan un gen en relación con el número total de células en ese tipo de célula.D, gráfico UMAP codificado por colores para la expresión (de azul a púrpura) de genes marcadores para los mCAF.E, curvas OS de Kaplan-Meier de pacientes con TCGA HGSOC agrupados por la firma de los 10 genes principales de los marcadores mCAF.Los valores de p se calcularon mediante una prueba de rango logarítmico.F, tinción IF de α-SMA, vimentina, COL3A, COL10A y MMP11 en CAF primarios derivados de ascitis HGSOC.G, Los niveles de expresión de proteínas de biomarcadores mesenquimales, incluidos ZEB1, vimentina y caracol, se analizaron en células de cáncer de ovario A2780 y OVCAR3 solas o transwell cocultivadas con CAF primarios mediante análisis de transferencia Western.Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con GAPDH.El valor normalizado del grupo de control se fijó en 1, y los niveles de proteína relativos del grupo de muestra se muestran como media ± DE.Los resultados se promediaron a partir de tres experimentos independientes.H, Imágenes representativas para el análisis de invasión de células A2780 y OVCAR3 solas o transwell cocultivadas con CAF primarios.Los datos son la media ± DE de tres experimentos independientes.*, P < 0,05;**, p < 0,01;***, P < 0,001.Grupos de fibroblastos en tejidos ováricos no malignos y tumores HGSOC.A, gráfico UMAP con grupos delimitados por colores que demuestran 14 grupos distintos basados ​​en diferencias de expresión génica para 13 201 fibroblastos.B, gráfico UMAP codificado por colores para la expresión (de azul a púrpura) de genes marcadores para los grupos de fibroblastos no malignos como se indica.C, Diagrama de puntos del ligando de quimiocinas de compartimiento cruzado y la expresión del receptor de quimiocinas correspondiente por el tipo de célula de mCAF y TME.La intensidad del color de cada punto representa la expresión media normalizada por scran en todos los pacientes.El tamaño de los puntos indica la proporción de células que expresan un gen en relación con el número total de células en ese tipo de célula.D, gráfico UMAP codificado por colores para la expresión (de azul a púrpura) de genes marcadores para los mCAF.E, curvas OS de Kaplan-Meier de pacientes con TCGA HGSOC agrupados por la firma de los 10 genes principales de los marcadores mCAF.Los valores de p se calcularon mediante una prueba de rango logarítmico.F, tinción IF de α-SMA, vimentina, COL3A, COL10A y MMP11 en CAF primarios derivados de ascitis HGSOC.G, Los niveles de expresión de proteínas de biomarcadores mesenquimales, incluidos ZEB1, vimentina y caracol, se analizaron en células de cáncer de ovario A2780 y OVCAR3 solas o transwell cocultivadas con CAF primarios mediante análisis de transferencia Western.Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con GAPDH.El valor normalizado del grupo de control se fijó en 1, y los niveles de proteína relativos del grupo de muestra se muestran como media ± DE.Los resultados se promediaron a partir de tres experimentos independientes.H, Imágenes representativas para el análisis de invasión de células A2780 y OVCAR3 solas o transwell cocultivadas con CAF primarios.*, P < 0,05;**, p < 0,01;***, P < 0,001.*, P < 0,05;**, p < 0,01;***, P < 0,001.***, P < 0,001.*, P < 0,05;**, p < 0,01;***, P < 0,001.***, P < 0,001.Los costos de publicación de este artículo fueron sufragados en parte por el pago de los cargos por página.Inicia sesión o crea una cuenta